細胞塊・スフェロイド三次元培養マイクロプレート「TASCL」の製造販売/クリニック向けPRP治療・幹細胞治療など再生医療導入支援サービス

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TASCLの取り扱い説明動画/TASCL manual movie

TASCLの使い方説明動画

 

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TASCL マニュアル/TASCL Manual

   

TASCLは現状、研究用途としてお使いいただけます。
TASCLで培養した細胞塊をヒトに投与することは、原則認められていません。
※臨床研究等の場合はご相談ください。
 
以下は標準的なプロトコールですが,アプリケーションに応じて,調整してください.
 
 

クリーンベンチ/安全キャビネット内に用意するもの

・TASCL(6穴プレートにセットされた状態)
・ピペット
・培地
・余分な培地を回収する容器
・細胞懸濁液(細胞播種をする場合)
・回収した細胞塊を入れる容器(細胞塊を回収する場合)
 
 

1.TASCLの上から培地を滴下し気泡の有無を確認する

培地(あるいは緩衝液)2ml程度をTASCLの上から滴下し,TASCLのマイクロウェル全体に行き渡らせます.マイクロウェル内に気泡の有無を確認します。
  
気泡がある場合は,気泡が光に反射するため,マイクロウェル内が白っぽく見えます.
 
気泡がTASCLのマイクロウェル(正方形)全体の5%以上に認められる場合,または気泡を除去したい場合は、次の手順2で気泡を除去します。気泡を除去しない場合は手順3に進みます。
 

▲気泡がある状態 白っぽいウェルが気泡(この場合95%程度に気泡がある)
 
 
▲気泡がない状態 マイクロウェル内が白っぽくない

 
 

2.マイクロウェル内の気泡をピペットのチップの先端で除去する

1に続き、TASCL上に培地が2ml程度ある状態で,ピペットのチップの先端でTASCLの格子状の部分をこすり,気泡を除去します.
 
TASCLの格子状部分にチップの先端が引っかかったときにTASCLのマイクロウェルが広がるため,気泡が除去されます.
(TASCLはシリコーン製で柔軟性があるため,チップの先端でひっかいてもチップを離せば元に戻ります.)
 

 
▲気泡を除去
 

 

▲気泡がない状態

 
  

3.細胞懸濁液の調製

【TASCL600の場合】
マイクロウェル1個当たりの細胞数 × 621 の細胞を培地0.5mlに懸濁します.
 
【TASCL1000の場合】
マイクロウェル1個当たりの細胞数 × 1020 の細胞を培地0.5mlに懸濁します.
 
 

4.細胞播種

TASCL上に残っている培地を除去します.
手順3.で調製した細胞懸濁液をTASCLのメッシュ上全体に行きわたるよう滴下し、細胞がメッシュの底に沈降するまで待ちます.
細胞の沈降は細胞および培地の比重に依存しますので、都度、倒立顕微鏡で確認して頂くことを推奨しますが、多くの場合30分以内です.
 
 

5.培地の追加

培地が蒸発して減少した場合、培地を追加します。
 
6穴プレートからカルチャーインサートをTASCLごといったん外すか,カルチャーインサートの隙間から,カルチャ―インサートの外側(6穴プレート上)に培地3.0mlを加えます.
 
培地の蒸発によってTASCLの表面が乾かないように,TASCL内の液面とカルチャーインサートの外側(6穴プレート上)の液面が同じになるように,TASCL内とカルチャーインサートの外側に培地を少しずつ追加して調整します.
 
※外側の培地の液面が,TASCL上の培地の液面と同じ高さ以上になるよう留意します.液面が低いと,長時間培養時には,TASCL上の培地がサイホン効果により流出する恐れがあります.
 
※培地を温める必要がある場合は、事前に10分程度インキュベータに入れるなどしてください.
 
 

6.培地交換

通常は,カルチャ―インサートの外側の培地のみ全量交換します.
※TASCL上の培地は,カルチャ―インサートの多孔質膜を介して,徐々に新しい培地と交換されます.
 
 

7.細胞塊回収

十分量の培地をTASCL上に加え,ピペッティングにより,細胞塊を浮遊させ,培地と共に回収します.
 
なお,TASCLのマイクロプレートの正方形の角に近い部分は細胞塊が回収されずに残りやすいです.そのため,培地を加えてピペッティングして細胞塊を回収することを何度か繰り返します.
 
(ピペッティングで回収できない場合)
 ・細胞塊がTASCL側に接着している場合、TASCLをピンセット等で把持して、
  インサートから剥がし、緩衝液などが入った6ウェルプレートや遠沈管の中で
  ピペットの水流により落とします。
 
 ・細胞塊がカルチャ―インサートの表面に接着している場合、
  TASCLをピンセット等で把持してカルチャ―インサートから剥がし、
  カルチャ―インサート表面の細胞塊をスクレーパーなどでこすり落とします。

 
 
以上です。ご不明点はお問い合わせください。

 
 
【修正履歴】
2021.07.09 手順3にTASCL(6穴プレートごと)をインキュベータに入れる
      手順を削除.
      手順5の注意事項に培地を温める際の注意事項を※で追加。
2021.06.04 手順3にTASCL(6穴プレートごと)をインキュベータに入れる
      手順を追加.
      手順2,3,4,5に、気泡を除去した培地を抜いて、細胞播種後、
      培地を追加・調整する内容を修正.
   
2021.05.31 2021.01.29、2021.03.10、2021.04.16の修正点を見直し、
      TASCLの気泡除去の方法として、
      ピペットのチップの先端でこする、次の1~2 を追加。
                     「1.TASCLの上から培地を滴下し気泡の有無を確認する」 
      「2.TASCLのマイクロウェル内の気泡をピペットのチップの先端で除去する」 
      これにより蒸留水を個別に用意する必要が無くなりました。
2021.04.16 2021.03.10に修正した箇所の「純水」を「蒸留水」に修正
2021.03.10 2021.01.29に新規追加した「1.TASCLを純水に浸透させる」を
      「1.滅菌済み純水をTASCLに吹きかけて気泡を追い出す」と
      「2.純水を吸い取り培地で置換する」に変更しました。
      「2」の追加により旧工程 「TASCLをリンスする」を削除     
2021.01.29 「1.TASCLを純水に浸透させる」の工程を新規追加しました。
2019.12.26 「3.6穴プレートへの培地添加」「4.細胞播種」
      「5.培地量の調整」を修正または追加しました。
 

   
   
   

TASCLのアプリケーションノート

   
   
   

TASCL Manual in English

Materials to prepare in the clean bench or the safety cabinet

- TASCL (set on 6-well plate)
- Pipette
- Culture medium
- Collection container for excess medium
- Cell suspension (when seeding cells)
- Container for collected spheroids (when collecting spheroids)
 
 

1.Check for bubbles

With a pipette, add about 2 ml of medium or PBS to the entire microwell (square part) of TASCL.
Check how many bubbles are formed inside the microwell.
 
 
(This image uses distilled water instead of medium.)
 

▲Bubbles on microwells
 
If bubbles are found in 5% or more of the entire microwell, remove the bubbles in the next "2. Remove bubbles".
If there are few bubbles, proceed to "3. Cell seeding".

 
 

2.Remove bubbles

Scratch the grid of microwells with the pipette tip to remove air bubbles.
There is no problem if you can remove most of the bubbles.
 
(These image part uses distilled water instead of medium and is done outside the bench.)

 
▲Remove air bubbles on microwells
 

 

▲No bubble on microwells

 
  

3.Prepare the cell suspension

Prepare the cell suspension as follows.
 
TASCL 600 Wells:
Suspend 621 cells per microwell in 0.5 ml medium.
 
TASCL 1000 wells:
Suspend 1020 cells per microwell in 0.5ml medium.
 
 

4.Cell the cell suspension

Pipet and remove the medium remaining in TASCL.
 
Fill the medium to a height of approximately 3 mm on 6-well plate below the culture insert and shake left and right to blend.
 
Fill the cell suspension over the entire mesh part of TASCL.
 
 
 

5. adding medium

If the medium has decreased due to evaporation, add more medium.
 
Remove the Culture Insert and TASCL from the 6-hole plate or add 3.0 ml of medium to the outside of the Culture Insert (on the 6-hole plate) through the gap in the Culture Insert.

To prevent the surface of the TASCL from drying out due to evaporation of the medium, add medium to the inside of the TASCL and the outside of the Culture Insert (on the 6-hole plate) a little at a time so that the level of the medium in the TASCL and the level of the medium outside the Culture Insert (on the 6-hole plate) are the same.

The level of the culture medium on the outside of the insert should be at least as high as the level of the culture medium on the TASCL. If the level is low, the medium on TASCL may flow out due to the siphon effect during prolonged incubation.

If it is necessary to warm up the medium, place it in an incubator for about 10 minutes before incubation.
 
 
 

6.Medium change

Use a pipette to aspirate the medium in the 6-well plate.
 
(You can also aspirate through the gap between the outside of the culture insert and the 6-well plate without removing the culture insert.)
 
Add a new medium for a height of about 3 mm.
 
Set the culture insert.
 
Add medium to the mesh portion of the TASCL and adjust to the same level as the medium on the outer 6-well plate.
 
Medium exchange is now complete.
 
 

7.Recovery of spheroids

Aspirate and dispense the medium several times with a pipette, remove the spheroids from the TASCL, and aspirate the spheroids together with the medium.
 
Rinse TASCL by dispensing fresh medium into TASCL. Peel off the spheroids and pipette again to aspirate the spheroids with the medium.
 
If spheroids remain in the TASCL, aspirate the medium vigorously.
Repeat the above steps several times, as spheroids tend to remain in the square corners of the microwell.
 
If it is difficult to aspirate the spheroids, pull the disc-shaped silicone part of the TASCL with tweezers and remove it from the culture insert.
 
Then, the whole TASCL body can be rinsed with the medium, and the spheroids peeled off from the TASCL can be collected together with the medium.