細胞塊スフェロイド三次元培養マイクロプレート「TASCL」/病院・クリニック向けPRP治療・幹細胞治療・幹細胞塊治療・再生医療支援サービス

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TASCLのマニュアル(取り扱い説明)

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TASCLは現状、研究用途としてお使いいただけます。
TASCLで培養した細胞塊をヒトに投与することは、原則認められていません。
※臨床研究等の場合はご相談ください。

以下は標準的なプロトコールですが,アプリケーションに応じて,調整してください.
クリーンベンチ/安全キャビネット内に用意するもの
・TASCL(6穴プレートにセットされた状態)
・ピペット
・気泡除去用のピペット(例:100~1000μl、またはシリンジなど水流で気泡を除去する器材)
・培地
・滅菌水
・余分な滅菌水や培地を回収する容器
・細胞懸濁液(細胞播種をする場合)
・回収した細胞塊を入れる容器(細胞塊を回収する場合)
 

1.TASCLの上から滅菌水を滴下し気泡の有無を確認する

滅菌水2ml程度をTASCLのマイクロウェルの上から滴下し,マイクロウェル全体に行き渡らせます.マイクロウェル内に気泡の有無を確認します。

気泡がある場合は,気泡が光に反射するため,マイクロウェル内が白っぽく見えます.

気泡がTASCLのマイクロウェル(正方形)全体の5%以上に認められる場合,または気泡を除去したい場合は、次の手順2に進みます。気泡がなく気泡を除去しなくてよい場合は手順3に進みます。
 

TASCLに気泡がある状態

▲気泡がある状態 白っぽいウェルが気泡(この場合95%程度に気泡がある)

TASCLに気泡がない状態

▲気泡がない状態 マイクロウェル内が白っぽくない

 
 

2.マイクロウェル内の気泡を除去する

2-1、2-2、2-3のいずれかの方法で気泡を除去します。
 
2-1.インキュベータで気泡を除去する
  1の工程で滅菌水(または培地)を入れたままのTASCLを,37℃のインキュベータに30分ほど安置します.30分後,TASCLをインキュベータから取り出します.マイクロウェル内の気泡の存在を確認し,気泡がほとんど消滅していたら(気泡がマイクロウェル全体の5%以下になったら)「3.細胞懸濁液の調整」に進みます.

  マイクロウェル内に気泡が多く残っている場合は,2-2または2-3の方法をお試しください.
 
 
2-2. ピペットの水流で気泡を除去する
  滅菌水をTASCL上に継ぎ足して(カルチャーインサートの半分程度の高さまで)ピペットで滅菌水を吸い、気泡に強く吹きかけて、水流で気泡を除去します.(ピペットの代わりに使い捨てのシリンジなどを使っても構いません)

  マイクロウェル内の気泡がほとんど消滅したら(気泡がマイクロウェル全体の5%以下になったら)「3.細胞懸濁液の調整」に進みます.
  まだ気泡が多く残っている場合は,2-3もお試しください.
 
 
2-3. 遠心分離機にかけて気泡を除去する
  1の工程で滅菌水(または培地)を入れたままのTASCLを, フタをして遠心分離機にかけます.2000RPMで5分間ほど遠心すると,気泡が除去できます.マイクロウェル内の気泡がほとんど消滅したら(気泡がマイクロウェル全体の5%以下になったら)「3.細胞懸濁液の調整」に進みます.
 
 

3.細胞懸濁液の調製

【TASCL600の場合】
マイクロウェル1個当たりの細胞数 × 621 の細胞を培地0.5mlに懸濁します.

【TASCL1000の場合】
マイクロウェル1個当たりの細胞数 × 1020 の細胞を培地0.5mlに懸濁します.
 
 

4.細胞播種

マイクロウェル内や6穴プレート上に残っている滅菌水をピペットで吸引除去し,マイクロウェルと6穴プレートを培地でリンスして,培地を吸引除去します.マイクロウェル内に2ml程度の培地を注入します.

手順3.で調製した細胞懸濁液をTASCLのメッシュ上全体に行きわたるよう滴下し、細胞がメッシュの底に沈降するまで待ちます.
細胞の沈降は細胞および培地の比重に依存しますので、都度、倒立顕微鏡で確認して頂くことを推奨します.多くの場合,細胞は30分以内で沈降します.
 
 

5.培地の追加

6穴プレートからカルチャーインサートをTASCLごといったん外すか,カルチャーインサートの隙間から,カルチャ―インサートの外側(6穴プレート上)に培地3.0mlを加えます.

培地の蒸発によってTASCLの表面が乾かないように,TASCL内の液面とカルチャーインサートの外側(6穴プレート上)の液面が同じになるように,TASCL内とカルチャーインサートの外側に培地を少しずつ追加して調整します.
なお,今後,培地が蒸発して減少した場合も,同様の方法で培地を追加します.

※外側の培地の液面が,TASCL上の培地の液面と同じ高さ以上になるよう留意します.液面が低いと,長時間培養時には,TASCL上の培地がサイホン効果により流出する恐れがあります.

※培地を温める必要がある場合は、事前に10分程度インキュベータに入れるなどしてください.
 
 

6.培地交換

通常は,カルチャ―インサートの外側の培地のみ全量交換します.
※TASCL上の培地は,カルチャ―インサートの多孔質膜を介して,徐々に新しい培地と交換されます.
 
 

7.細胞塊回収

十分量の培地をTASCL上に加え,ピペッティングにより,細胞塊を浮遊させ,培地と共に回収します.

なお,TASCLのマイクロプレートの正方形の角に近い部分は細胞塊が回収されずに残りやすいです.そのため,培地を加えてピペッティングして細胞塊を回収することを何度か繰り返します.

(ピペッティングで回収できない場合)
 ・細胞塊がTASCL側に接着している場合,TASCLをピンセット等で把持して,インサートから剥がし,緩衝液などが入った6ウェルプレートや遠沈管の中でピペットの水流により落とします.

 ・細胞塊がカルチャ―インサートの表面に接着している場合,
  TASCLをピンセット等で把持してカルチャ―インサートから剥がし,
  カルチャ―インサート表面の細胞塊をスクレーパーなどでこすり落とします.


以上です。ご不明点はお問い合わせください。


【修正履歴】
2022.11.8 気泡除去の方法としてピペットの水流で除去する方法を2-2として独立させた.
      またエタノールを使用する方法は削除した.
2022.10.25 気泡除去の方法として2-2に遠心分離機にかける方法を追加.
2022.10.18 気泡除去で用いる道具としてオートピペットをピペットに変更
2022.10.11 手順1では培地の代わりに滅菌水を使うよう修正.
      手順2ではピペットの先端でマイクロウェルをひっかいて
      気泡を除去する際に、マイクロウェル部分がカルチャーインサートから
      外れてしまう場合があることが判明したため、この方法を回避。
      気泡を除去する方法として、インキュベータに入れるか、
      オートピペット等の水流で気泡を除去するか、エタノールを使う方法に改訂.
2021.07.09 手順3にTASCL(6穴プレートごと)をインキュベータに入れる
      手順を削除.
      手順5の注意事項に培地を温める際の注意事項を※で追加。
2021.06.04 手順3にTASCL(6穴プレートごと)をインキュベータに入れる
      手順を追加.
      手順2,3,4,5に、気泡を除去した培地を抜いて、細胞播種後、
      培地を追加・調整する内容を修正.  
2021.05.31 2021.01.29、2021.03.10、2021.04.16の修正点を見直し、
      TASCLの気泡除去の方法として、
      ピペットのチップの先端でこする、次の1~2 を追加。
「1.TASCLの上から培地を滴下し気泡の有無を確認する」
      「2.TASCLのマイクロウェル内の気泡をピペットのチップの先端で除去する」
      これにより蒸留水を個別に用意する必要が無くなりました。
2021.04.16 2021.03.10に修正した箇所の「純水」を「蒸留水」に修正
2021.03.10 2021.01.29に新規追加した「1.TASCLを純水に浸透させる」を
      「1.滅菌済み純水をTASCLに吹きかけて気泡を追い出す」と
      「2.純水を吸い取り培地で置換する」に変更しました。
      「2」の追加により旧工程 「TASCLをリンスする」を削除     
2021.01.29 「1.TASCLを純水に浸透させる」の工程を新規追加しました。
2019.12.26 「3.6穴プレートへの培地添加」「4.細胞播種」
      「5.培地量の調整」を修正または追加しました。

TASCL Manual in English

Materials to prepare in the clean bench or the safety cabinet

- TASCL (set on 6-well plate)
- Pipette
- Culture medium
- Collection container for excess sterilized water and medium
- Cell suspension (when seeding cells)
- Container for collected spheroids (when collecting spheroids)
 
 

1.Check for air bubbles

  With a pipette, add about 2 ml of sterilized water (or medium or PBS) to the entire microwell (square part) of TASCL.
  Check how many bubbles are formed inside the microwell.
 
  If bubbles are found in 5% or more of the entire microwell, remove the bubbles in the next "2. Remove bubbles".  If there are few bubbles, proceed to "3. Cell seeding".

▲Bubbles on microwells 

 
 

2.Remove bubbles in microwells

  Remove air bubbles by either method 2-1, 2-2, or 2-3.
 

 
▲No bubble on microwells

 
2-1. Remove air bubbles in the incubator
 
  Place the TASCL with sterilized water (or medium) in the incubator at 37°C for about 30 minutes in step 1. After 30 minutes, remove the TASCL from the incubator.
 
  Check the presence of air bubbles in the microwells, and if the air bubbles have almost disappeared (when the air bubbles are less than 5% of the entire microwell), proceed to "3. Adjusting the cell suspension".
If many bubbles remain in the microwells, try method 2-2 or 2-3.
 

 
2-2. Remove air bubbles with pipette water flow
 
  Add sterilized water onto the TASCL (up to about half the height of the culture insert), suck the sterilized water with a pipette, blow it strongly on the air bubbles, and remove the air bubbles with a water flow. (You can use disposable syringes instead of pipettes.)
 
  When the bubbles in the microwells have almost disappeared (when the bubbles are less than 5% of the entire microwells), proceed to "3. Adjusting the cell suspension".
  If there are still many bubbles, please try 2-3.
 

 
2-3. Centrifuge to remove air bubbles
 
  In step 1, the TASCL with the sterilized water (or culture medium) still in it is put on the lid and centrifuged. Air bubbles can be removed by centrifuging at 2000 RPM for about 5 minutes.
 
  When most of the bubbles in the microwells have disappeared (when the bubbles are less than 5% of the entire microwells), proceed to “3. Adjusting the cell suspension”.
 
  

3.Prepare the cell suspension

  Prepare the cell suspension as follows.
 
TASCL 600 Wells:
Suspend 621 cells per microwell in 0.5 ml medium.
 
TASCL 1000 wells:
Suspend 1020 cells per microwell in 0.5ml medium.
 
 

4.Cell the cell suspension

  Aspirate the sterile water remaining in the microwells and on the 6-well plate with a pipette, rinse the microwells and 6-well plate with medium, and aspirate the medium. Inject about 2 ml of medium into the microwell.
 
  Drop the cell suspension prepared in step 3 over the entire surface of the TASCL mesh and wait until the cells settle to the bottom of the mesh. Cell sedimentation depends on the specific gravity of the cells and the medium, so it is recommended to check with an inverted microscope each time. In most cases, cells settle within 30 minutes.
 
 
 

5. adding medium

  Remove the culture insert together with TASCL from the 6-well plate, or add 3.0 ml of medium to the outside of the culture insert (on the 6-well plate) through the gap in the culture insert.
 
  To prevent the surface of the TASCL from drying out due to medium evaporation, add a small amount of medium to the inside of the TASCL and the outside of the culture insert so that the liquid level inside the TASCL and the outside of the culture insert (on a 6-well plate) are the same. Add one by one and adjust.
 
  In the future, even if the medium evaporates and decreases, the medium will be added in the same way.

*Make sure that the liquid level of the medium on the outside is at least the same height as the liquid level of the medium on the TASCL. If the liquid level is low, the medium on the TASCL may flow out due to the siphon effect during long-term culture.
*If it is necessary to warm the medium, put it in the incubator for about 10 minutes beforehand.
 
 
 

6.Medium change

  Use a pipette to aspirate the medium in the 6-well plate.
(You can also aspirate through the gap between the outside of the culture insert and the 6-well plate without removing the culture insert.)
 
  Add a new medium for a height of about 3 mm.
 
  Set the culture insert.
 
  Add medium to the mesh portion of the TASCL and adjust to the same level as the medium on the outer 6-well plate.
 
  Medium exchange is now complete.
 
 

7.Recovery of spheroids

  Aspirate and dispense the medium several times with a pipette, remove the spheroids from the TASCL, and aspirate the spheroids together with the medium.
 
  Rinse TASCL by dispensing fresh medium into TASCL. Peel off the spheroids and pipette again to aspirate the spheroids with the medium.
 
  If spheroids remain in the TASCL, aspirate the medium vigorously.
Repeat the above steps several times, as spheroids tend to remain in the square corners of the microwell.
 
  If it is difficult to aspirate the spheroids, pull the disc-shaped silicone part of the TASCL with tweezers and remove it from the culture insert.
 
  Then, the whole TASCL body can be rinsed with the medium, and the spheroids peeled off from the TASCL can be collected together with the medium.
 

 
Revised on November 8, 2022

TASCLのアプリケーションノート